レジオネラ文献

温浴施設の微生物汚染の現状と対策

我々の施設で検査した浴槽水のレジオネラ属菌検出率は2001年30%、~2003年13%と低下、その後は2012年まで大きな変動なく10%程度である。浴槽水質における大腸菌群検出率は0.7%(2014年4月~2015年3月)であり、レジオネラ属菌対策の困難さを示している。
設備構造面のポイントは、
①給湯水は60℃以上の供給能力 ②塩素剤などの注入制御設備③浴槽水の回収槽は設けない ④バイオフィルムが付着しやすく除去しにくいろ材を使用しない ⑤行き止まり、滞留配管を設けない ⑥バイオフィルムが付着する隙間をなくす
維持管理面では正確なレジオネラ属菌検査が重要である。PHEの外部精度管理を採用し、正確な検査能力を有する機関での検査が望ましい。培養法は日常管理でレジオネラ属菌が不検出であることの確認に、遺伝子法は除菌洗浄後の不検出確認に使用する。ポイントとしては、
①日常的な洗浄と消毒 ②定期的な科学的除菌洗浄 ③浴槽水の遊離残留塩素濃度の維持 ④温泉水質によってはモノクロラミン濃度維持が有効 ⑤給湯水では末端55℃以上とする などがある。
温浴施設では浴槽水に加えて足ふきマット、シャワーカーテン、シャワー取っ手、床面などの微生物汚染のリスクポイントを把握し、より良い衛生管理に役立てることが必要である。

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比色系パルサー法を用いた冷却塔水レジオネラ属菌の生菌迅速検査法の検討

現在、冷却塔水に生息するレジオネラ属菌の検出は培養法が用いられている。しかし結果が出るまでに1週間前後時間を要すること、培地に抗生物剤を添加するため実際に存在する菌数よりも検出される菌数が減少している。またVNC状態のレジオネラ属菌も存在する。
今回、従来の培養法と比色系パルサー法でレジオネラ属菌の検出を試み、比較検討を行った。比色系パルサー法では6検体全てが陽性だったのに対して、培養法では3検体が<10 CFU/100mLで検出できなかった。これは培養法で用いた選択培地の影響で菌数が検出限界以下に減少、またVNC状態のレジオネラ属菌が存在していることによると考えられた。
本結果により、比色系パルサー法は冷却塔水中に生息するレジオネラ属菌のスクリーニングツールとして利用できることが示された。

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レジオネラ属菌培養検査の外部精度管理試験(PHE)の紹介

レジオネラ属菌の培養検査は高い検査精度が求められるため、外部精度管理プログラムに参加して検査精度を評価することが望ましい。最新のPublic Health England(PHE、2010年以前はHPA)外部精度管理試験の概要と有用性について報告する。
PHEから航空便で送付される試料を用いて、調節した試料水の濃縮、前処理、選択培地への接種、培養、判定、菌種同定の工程を行い、試料水に含まれるレジオネラ属菌の検出菌数と菌種をPHEに報告するとPHEは参加機関から集まった結果を集計し、その結果が参加検査機関にフィードバックされる。試料は年間6回、2検体ずつ届き、過去4回の試験結果で合計8検体、1検体当り最高12点で評価される。本プログラムには欧州を中心に150の検査機関が参加している。
我々は1998年から参加しているが、2014年8月~2015年3月の成績では83点満点中83点であった。試験においては遠心濃縮法とろ過濃縮法はどちらも濃縮方法として十分な精度をもつことが確認された。継続して参加するなかで、評価結果を受けて様々な検査方法の改善に取り組んでおり、検査精度を向上させるきっかけとなった。
よって、外部精度管理プログラムへの参加はレジオネラ属菌の培養検査の精度向上に有用であると考える。

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培養法と遺伝子検出法によるレジオネラ属菌検査結果の相違に関する検討

培養法による環境水のレジオネラ属菌検査は結果が得られるまでに1週間以上を要し、培地に発育できるレジオネラ属菌のみを検出する。一方、遺伝子検出法は数時間で検査結果を得られるが、死菌も含めてレジオネラ属菌のDNAを広く検出する。この問題への対応としてEMA処理が実用化されている。
今回、浴槽水3試料、冷却水11試料を用いて培養法とEMA-qPCR法の検出結果を比較した。培養法の結果、浴槽水3試料からLegionella pneumophila が優占種として検出された。冷却水は8試料からL.pneumophila、1試料から Legionella sp.LC2720が優占種として検出され、2試料からは検出されなかった。EMA-PCR法では全ての試料からレジオネラ属菌の16SrRNA遺伝子が検出された。検出されたL.pneumophila クローンの割合は浴槽水試料32~99%、冷却水試料0~11%。各試料から得られたOTUの数は浴槽水試料は2~7、冷却水試料は2~29。冷却水は浴槽水と比べてレジオネラ属菌の多様性が明らかに高かった。
本調査の結果から、環境水中には培養法で検出されないレジオネラ属菌が存在し、特に冷却水には既存種に分類されないレジオネラ属菌の生菌が多く存在することが示唆された。
環境水のレジオネラ属菌検査では培養法で検出されないレジオネラ属菌の存在を考慮した上で、培養法及び遺伝子検出法の特性を理解して、結果を解釈することが重要と考えられる。

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アメーバ共培養法を用いた浴槽水中に存在するレジオネラ属菌汚染実態の解明

レジオネラがアメーバ内で増殖することを利用したアメーバ共培養法の手法を使って、生存しているが人工培地で培養できない状態や培養不能菌種も含めたレジオネラを検出し、浴槽水中レジオネラ汚染実態調査を行った。入浴施設から浴槽水71試料を採取しアメーバ共培養法、培養法、real-time qPCRを組み合わせた方法を用いてレジオネラ菌数などの比較検討を行った。
培養法では浴槽水試料は12試料、アメーバ共培養後試料は5試料からレジオネラを検出した。菌種はすべてL.pneumophilaであった。real-time qPCR法では浴槽水試料は46試料、アメーバ共培養後資料は63試料が陽性であった。浴槽水試料とアメーバ共培養後試料のレジオネラ数を比較して、101cell/1以上増殖が確認されたのは31試料であった。またreal-time qPCR法で陰性だった試料のうち、アメーバと共培養することにより15試料が陽性となった。菌種については、浴槽水は22試料、アメーバ共培養法後の試料は21試料からL.pneumophila、L.maceachernii などを検出したが、培養不能菌種は検出されなかった。

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金属錯体を活用したレジオネラ属菌の殺菌方法

過酸化水素等を用いた酸素系洗浄剤は酸化分解能力が低いことから、過酸化水素の活性化触媒として金属錯体を用いた洗浄剤の研究を行ってきた。一方、公衆浴場では循環式浴槽の配管洗浄剤として過酸化水素等を用い配管内のバイオフィルム洗浄が従来行われているが、分解による発泡が原因で循環ポンプが停止する等の課題がある。近年では過炭酸ナトリウムが代替として使用されているが、過酸化水素と同等の殺菌性能があるのか懸念されている。本研究では金属錯体と過炭酸ナトリウム併用の殺菌効力について検討した。
BCYE寒天培地を用い、試験菌としてLegionella pneumophilaATTCC33153SG1を、試験液として3薬剤(①0.5%過炭酸ナトリウム水溶液、②0.1%金属錯体+0.5%過炭酸ナトリウム水溶液、③3%過酸化水素水液)を用いた。①では本試験条件において殺菌効果があることが確認できた。②ではより短時間での殺菌効果が得られることが確認できた。また5分間の作用時間で③と同等の殺菌効果があることが確認できた。
以上の結果より、過炭酸ナトリウムと金属錯体の併用により過酸化水素水と同様に酸化力を有する洗浄剤であることが確認できた。

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気泡発生装置使用浴槽におけるモノクロラミン消毒効果の検証

気泡発生装置付き浴槽においても普通浴槽と同様なモノクロラミン消毒の殺菌効果が得られるかを検証するため実証実験を行った。
静岡県内の気泡発生装置付き浴槽を有する3営業施設において、モノクロラミンの生成・注入装置による機械注入または直接投入により、概ね3mg/Lの濃度維持を目標にモノクロラミンを添加した。長期間試験を行った2施設では週一回の完全換水と循環配管内の高濃度モノクロラミン洗浄または過酸化水素洗浄を実施した。
いずれの施設でもレジオネラ属菌、自由生活性アメーバは検出されず、その消毒効果が裏付けられた。消毒副生成物の生成は遊離塩素管理時より少なくいずれの施設の浴槽からも塩素臭の原因となるトリクロラミンは検出されなかった。またモノクロラミンの添加量と維持濃度について気泡発生装置によるモノクロラミンの失活は認められなかった。
以上のことから、洗浄消毒が容易でない気泡発生装置使用浴槽においてもモノクロラミンによる管理は有用であると考えられた。

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循環式浴槽水のモノクロラミン消毒による長期間にわたるレジオネラ属菌の制御

泉質の異なる温泉水を用いた2カ所(静岡市と浜松市の施設)の循環式の入浴施設に、モノクロラミンのタイマー注入装置を設置し、アンモニウム源として従来の塩化アンモニウムより入手しやすい硫酸アンモニウムを使用し、また塩素剤とアンモニウムのモル比を従来の1:2.5から1:1.5に低減した長期運用試験を行った。
静岡市の施設は1日の平均利用者が319人の循環式露天風呂で泉質はナトリウム-炭酸水素塩泉。試験期間は3ヵ月間で期間中6回採水、検査に供した。浜松市の施設は1日の平均利用者が554人の循環式室内風呂でナトリウム-カルシウム塩化物泉。試験期間は5ヵ月で期間中8回採水した。また週に1回完全換水とろ過器を含む循環配管内の高濃度モノクロラミン洗浄または過酸化水素洗浄を実施した。
運用試験の結果、両施設とも目標濃度を概ね維持できた。従来の遊離塩素消毒では利用者数や追加湯量の影響により濃度管理が困難であったが、モノクロラミンは安定維持が可能であった。微生物検査ではレジオネラ属菌は不検出、消毒副生成物の発生も少なかった。アンモニウム源として硫酸アンモニウムが使用可能で、モル比を低減でき、薬剤コストの削減も得られた。

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日本で分離されたLegionella pneumophila血清群1のsequence-based typing法による解析

レジオネラ症起因菌の8割を占めるL. pneumophilla血清群1の患者由来株196株をsequence-based typing(SBT)法により遺伝子型別した。環境由来株344株も合わせて、minimum spanning treeを作成したところ、9つの大きなグループが形成された。主に感染源不明の臨床由来株からなるグループ(U)以外は、環境由来株の由来毎にグループが形成された。浴槽水由来株の多くが属する3つのグループ(B1,B2,B3)、土壌由来株のほとんどを含む3つのグループ(S1,S2,S3)、冷却塔水由来株が属する2つのグループC1,C2)である。患者由来株の分布は各グループおよびクループ外に散在していたが、感染源が浴槽水と推定あるいは確定している119株のうち77株(65%)がB1-3グループに属していたのに対し、それ以外の感染源あるいは感染源が不明の117株中B1-3グループに属するものは36株(20%)だった。畑仕事等の土壌や、塵埃などが感染源として推定されている患者由来株は18株と少なかったが、そのうち16株が、S1-3グループに属していた。したがって感染源不明の臨床分離株がどのグループに属するかを調べることにより、遺伝子型から感染源の種類が推測できる可能性が示唆された。

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レジオネラ菌は小胞体内での移行にRab4及びRab10を利用する

レジオネラ菌は、宿主細胞内の膜輸送および膜融合機構を操作することで宿主内での生育及び増殖を可能としている。また、この操作の過程においてレジオネラ菌から宿主細胞に放出されるレジオネラエフェクターが必須の役割を果たしている。これまでの研究により、レジオネラエフェクターであるLidAと宿主細胞内に存在する低分子量GTP結合タンパク質であるRab4及びRab10との結合を見いだした。レジオネラ菌感染が小胞体においてこれらRabタンパク質を利用しているのかは明らかになっていない。
本研究ではレジオネラ菌が小胞体との融合過程において、滑面小胞体より小胞体内に侵入した後、粗面小胞体へと移行することを明らかにした。また、Rab10の発現抑制でレジオネラ菌と滑面小胞体との融合が阻害され、Rab4の発現抑制で粗面小胞体への移行が阻害されていることを見いだした。さらに、Rab10及びRab4はそれぞれ滑面小胞体、粗面小胞体形態維持タンパク質と結合することを明らかにした。