LAMP法を用いた浴槽水からのレジオネラ属菌検出時における反応阻害確認の必要性

目的
LAMP法は培養法に比べ短時間で検査結果が得られ検出感度も高いことから公衆浴場等の衛星状況の把握に活用されているが、環境水を対象とした場合、環境水中に存在する物質によるDNA増幅が阻害されることが指摘されている。阻害物質によりレジオネラ属菌が存在していても陰性と判定される偽陰性の可能性があることから、遺伝子検査法では試料中の阻害物質の有無についても併せて検討する必要がある。しかし乍らその発生頻度等については十分に明らかにされていない。今回、LAMP法で浴槽水のレジオネラ属菌の検出を行う際に反応阻害の有無、及びその発生頻度を検討するとともに、反応阻害確認の必要性について検討した。

方法
検査試料として入浴施設等の浴槽水71試料を採取、種別は薬湯13、白湯58(水道水45、井戸水13)。これらをレジオネラ症防止指針に示された方法にて濃縮し用いた。
1.培養法による検出所定の方法にて培養後、L-システイン要求性を試験するためBCYE-α寒天培地(栄研化学)と羊血液寒天培地(日研生物研究所)に植え継ぎ、L-システイン含有の培地のみに発育したコロニーをレジオネラ属菌と判定した。菌種同定は免疫血清によるスライド凝集反応とDNA-DNAハイブリタイゼーション(極東製薬)により行った。
2.LAMP法による検出濃縮試料からアルカリ熱抽出方法によりDNAを抽出し、LAMP法はレジオネラ検出試薬キット(栄研化学)を用いプロトコール通りに行った。1試料につき2本のチューブを用意し、2本目には反応阻害物質有無の確認のためキット添付の陽性コントロールをインターナルコントロールとして添加した。リアルタイム濁度測定装置(栄研化学)を用いてDNA増幅の有無を確認、増幅が認められなかった試料についてDNA抽出試料の希釈及び精製を行い再度LAMP法を実施した。希釈は阻害物質の影響低減のためDNA抽出液をTE緩衝液で10倍に希釈、又精製は阻害物質除去のためEthachinmate(ニッポンジーン)を用いて行った。
3.浴槽水の水質分析LAMP法でインターナルコントロールが陰性の試料について所定の方法で金属成分の分析を行い、マンガン、カルシウム、マグネシウム、ナトリウムの測定を行った。
4.模擬薬湯水のLAMP法反応阻害確認薬用植物を水道水に混合した模擬浴槽水を作り、陽性コントロールをインターナルコントロールとして添加したLAMP法を行った。濃縮試料は上記同様に2本のチューブを用い、1本は試料水と同様にDNAを抽出、2本目は遠心濃縮のみを行い、アルカリを加えなかった。
5.実験結果
①浴槽水71飼料の内、LAMP法により27試料(38%)、培養により12試料(16.9%)からレジオネラ属菌が検出された。LAMP法陰性の44試料の内、インターナルコントロール陰性は4試料(5.6%)、内、培養法でレジオネラ属菌が検出されたのは1試料であった。培養法による検出菌数は70〜16、000CFU/100ml、菌種はL.pneumophila、血清群はSG1、3、5、10であった。
②インターナルコントロール陰性の4試料の再試験結果は、希釈したものは4試料全てでLAMP法陰性、インターナルコントロール陽性であった。精製したものも同様の結果であった。培養法でレジオネラ属菌が検出されたのは1試料で、検出菌数は5、000CFU /100ml、菌種はL.pneumophila、血清群はSG1、3であった。
③上記4試料は全て薬湯で、これらの原水は水道水2試料、井戸水2試料であった。
④金属分析の結果は井戸水の1試料が鉄、マンガンが他の3試料と比べ値が高く、マンガンは水道水質基準を超えていた。3試料は全項目で水道水質基準内であった。
⑤模擬薬湯水はチューブ1本目はインターナルコントロール陰性、アルカリを加えず濃縮のみ行った2本目はインターナルコントロールが陽性であった。

結果と考察
今回、LAMP法により5.6%の試料で反応阻害が認められ、偽陰性の可能性のある試料が存在した。反応阻害が認められたのは薬湯であったことから薬用植物により反応が阻害された可能性が考えられる。模擬薬湯の実験結果からはアルカリを用いたDNA抽出過程により生じた何らかの物質によりDNA増幅反応が阻害された可能性が示唆された。金属イオンの影響については今回は確認出来なかった。また、実験結果②が示すように反応阻害物質の濃度がDNA増幅反応に影響を受けることも示唆された。反応阻害が認められた4試料の内の1試料は培養によりレジオネラ属菌が検出されたが菌数、菌種から阻害物質が存在していなければLAMP法は陽性であると考えられる。DNA抽出液を精製することにより阻害物質は除去できたが、抽出されたDNAは検出限界値以下であり、一方、希釈液については計算上は陽性となるが実際には陰性であったことからもこの試料はDNAが抽出出来ていない可能性が高いと考えられる。以上の結果から、LAMP法においても偽陰性となる可能性が明らかになった。LAMP法によるレジオネラ属菌検出時には、同時に反応阻害確認を行う必要性が認められた。

TRC法を原理とするレジオネラ属菌16S rRNA検出試薬の開発

目的
レジオネラ肺炎感染予防には定期的な環境水のレジオネラ検査が必要であるが、一般的に使用される培養法は結果を得る迄に7〜10日を要し、感度も十分ではないことから、迅速且つ高感度な検査が可能な遺伝子検査試薬を開発した。

方法と成績
開発した試薬(TRC法を測定原理とし、レジオネラ属菌16S rRNAを標的とした遺伝子検査試薬)を入浴施設などから採取した環境水156検体についてLAMPキットと比較した結果、レジオネラ属菌7菌種の検出感度は1〜51CFU/assayで、LAMPキットと比較して7菌種中6菌種で高感度、1菌種で同等であった。環境水でも検出率79%で、LAMPキットの68%を上回った。この内、LAMPキットで陰性、本試薬で陽性の25検体を配列解析したところ、24検体でL.parisiensisを含む幅広いレジオネラ属菌を確認できた。

結論
本試薬はレジオネラ属菌を高感度かつ幅広い種を検出可能であり、レジオネラ症の感染予防に寄与すると考える。

冷却水のレジオネラ属菌検査結果

諸外国では冷却水を感染源とするレジオネラ症の集団発生の報告が多い。日本ではまだ少ないが、冷却水の管理実態を把握し、殺菌剤処理の効果を評価することは重要である。そこで過去8年間のレジオネラ属菌の検出情況を紹介すると共に、各種殺菌剤の有効性について検討する。

方法と結果
2000年4月より8年間に全国のビルや工場などから採取した37、820検体を培養法にて検査し、併せて殺菌剤の使用有無、種類を調査した。1.レジオネラ属菌数は以下の通りであった。
①10CFU/100ml未満25、992(69%) ②〜100 CFU/100ml未満4、375(12%)
③〜1000CFU/100ml未満3、470(09%) ④〜10000 CFU/100ml未満2、525(07%)
⑤10000CFU/100ml以上623(02%) ⑥検出不能835(02%) 2.上記⑥を除いた36、985検体の内、
①殺菌剤無処理2、793検体、内1、179件(42%)はレジオネラ属菌不検出。
②薬品処理22、461検体、内16、951件(75%)はレジオネラ属菌不検出。3.殺菌剤別レジオネラ属菌不検出率は以下の通りであった。
①イソチアゾリン系16640中、12、861(77%)
②カチオン系2040検体中、1、544(1544(76%)
③グルタルアルデヒド913中、800(88%)
④塩素系302中、145検体(48%)グルタルアルデヒデは化学的殺菌洗浄剤として使用されるため不検出率が高いと考えられる。イソチアゾリン、カチオン系も有効であったが塩素系は不検出率が低かった。考察:多検体の解析からレジオネラ属菌の防除に殺菌剤の使用が有効であることが示されたが、殺菌剤処理をしても検出される水系もあることから定期的な検査を行い、対策にフィードバックしていくことが必要である。

温泉水中のレジオネラ属菌の検出におけるパルサー法の有効性についての検討

目的
温泉水中のレジオネラ属菌の検出ではWYOα寒天培地などを用いた培養法が一般的だが、この方法は培地に雑菌の生育を抑制する抗菌剤が添加されているため実際より検出菌数が減少し、又検出にも4日以上の時間を要する。そこで生菌のみが短時間で検出できる新しい核酸検出法パルサー法に着目し、その有効性について検討した。

方法
L.pneumophilaを添加した異なる泉質の温泉水をろ過濃縮しフィルター表層を滅菌スワブで集め5mlの滅菌水に懸濁し、パルサー法、培養法、ATP法、及びPCR法によりレジオネラ属菌を検出、比較した。又、L.pneumophilaを添加した蒸留水に種々消毒剤を一定量添加し、同様に処理しそれぞれの方法を比較、検討した。

結果および考察
予備検討の段階であるが1.次亜塩素酸ナトリウムによる消毒試験培養法:強い殺菌効果が認められた。パルサー法:0.4ppmの値で4.4×102CFU/mlを示したが、濃度が高くなるにつれて菌数が指数関数的に減少する傾向を示した。2.銀イオン消毒試験培養法:強い殺菌効果が認められた。パルサー法:殺菌効果は認められなかった。3.試料温泉水のレジオネラ属菌検出菌数パルサー法による検出菌数は培養法とPCR法の間に位置していた。培養法は選択培地の影響で1オーダー近く実際の菌数よりも少なくなり、又、培養不能なVNC状態のレジオネラ細胞も含まれる可能性を示唆している。今後、パルサー法が生菌状態のレジオネラ属菌の検出方法として現場で簡便に利用できるようにしたい。

免疫磁気ビーズ法を用いたレジオネラ属菌の分離法

目的
レジオネラ症患者の感染源を探る上で環境水からのレジオネラ属菌(以下L菌)の分離は重要である。一般的には濃縮方法(ろ過法、冷却遠心法)を用いるが濃度の高い試料ではろ過出来なかったり、L菌の培養に時間を要することから雑菌による妨害除去のため前処理が行われるが雑菌を全て除き、L菌だけを培養することは困難である。これらの課題を解決する手法として、免疫磁気ビーズ法を用いて試験した。

方法
精製水にL菌(4段階濃度)と従属栄養細菌(2段階濃度)を添加した8試料、浴槽水32試料を用いた。ろ過法は浴槽水500mlをろ過し、滅菌蒸留水5mlで再懸濁(濃縮試料)し、50℃20分加熱処理し、100㎕をGVPC培地に塗沫しL菌の分離を行った。ビーズ法は45mlの浴槽水に緩衝液5mlとビーズ液150㎕を添加しミキサーで1時間反応させた後、5分間混和して上清を除去した。沈査に緩衝液50mlを加えミキサーで5分間洗浄後、同様に上清を除去し、緩衝液1mlで再懸濁して試料とし400㎕をGVPC培地に塗沫、L菌の分離を行った。高濃度の試料は目視で濁質が認められなくなるまで緩衝液洗浄を3回まで行った。

結果及び考察
①ビーズ法は6cfu/100mlまで検出可能で、検出限界値はほぼろ過法と同様であった。
②ろ過法ではGVPC培地に8.0×100〜1.0×102cfu/plateの雑菌が確認されたが、ビーズ法では1回の洗浄で0〜3.0×102cfu/plate、2回の洗浄0〜3.0×100cfu/plate、3回の洗浄で雑菌が全て除去された。
③浴槽水試料からのL菌分離はろ過法、ビーズ法の相関が高く良好な結果であった。
④雑菌が多い試料はろ過法ではGVPC培地上にL菌と共に雑菌のコロニーが出現、選別には熟練が必要である。一方ビーズ法では洗浄の過程で雑菌が取除かれていくため雑菌のコロニーが少なくなった。以上の結果からろ過法に比べ、ビーズ法はL菌のコロニーが雑菌のコロニーに埋没して検出が不可能になることを避けられ、純培養の時間短縮にも繋がると共に比較的容易にL菌のコロニーを判別できるなど、利点の多い手法と考えられる。

レジオネラ属菌の検出と同定におけるPCR法の検討

目的
近年、レジオネラ属菌の検出には、培養法が実施されているが、最終判定までに7〜9日を要し、迅速性に欠ける。今回、環境水(浴槽水、冷却塔水等)のレジオネラ属菌の検出と同定に、PCR法(Single PCR及びSeminested PCR)を検討したので報告する。

方法・結果
1Lの環境水を0.2μmフィルターにて吸引ろ過した後、0.2M HCI・KCI溶液で酸処理し、濃縮試料を調製した。培養には、GVPCα培地とBCYEα培地を用い、血清群別には、Legionella Latex Test Kitを用いて実施した。PCRとSeminest PCRには、LEGプライマー(16S rRNA gene)を使用し、分離菌からのDNAは、99℃、10分間の加熱抽出を行い、濃縮試料からのDNAは、QIAamp DNA Mini Kitを用いて抽出した。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動でサイズを確認した。分離したレジオネラ属菌の血清群別とPCR産物の確認から、血清群L.p1、L.p2-14、及びL.その他については、レジオネラ属菌特異的430bpのバンドを認めたが、L.不明では、バンドを認めなかった。

リアルタイムRT-PCR法を用いた環境水中のLegionella 属菌の迅速検出

目的
レジオネラ属菌の迅速な検出のためDNAを標的とした方法が数多く開発されているが、培養法をレファレンスとした場合、偽陽性が多くなることが報告されている。そこでこれを改善するために、RNAを標的としたリアルタイムRT-PCR法を開発し、25試料を用いて検討を行った。

方法
試料を遠心濃縮しRNAを抽出後、DNase処理、RTを行った。PCRにはCycleavePCR Legionella Detection Kit(TaKaRa)を使用し、リアルタイムPCR装置はSmartCycler(Cepheid)を用いてレジオネラ属菌の5SrRNAの検出を行った、同時に同一試料で培養法(ろ過濃縮)も実施しレジオネラ属菌の検出を行った。

結果
培養法は陽性率36%(9/25件)でその内訳は、100mlあたりの菌数が10〜90CFUが5件、100CFU以上が4件であった。PCR法は培養法をレファレンスとしたカットオフCt(Threshold Cycle)値の検討により陽性率44%(11/25件)で感度100%、特異度88%であり、従来のDNAをターゲットとした遺伝子検査法に比べ偽陽性が改善される傾向にあった。現在検体数を増加して検討継続中である。

LAMP法による浴槽水からのレジオネラ属菌迅速検査

目的
レジオネラ属菌の検査は、培養法による検査とLAMP法などの遺伝子検査がある。浴槽水のレジオネラ属菌検査にはLAMP法等の遺伝子検査法を用いることは現場におけるレジオネラ属菌管理対策に有用と考えられている。今回は、多検体の浴槽水について培養法とLAMP法により検査した。

方法・結果
2004年6月から2007年1月にかけて浴槽水730検体(118施設)を培養法とLAMP法によってレジオネラ属菌検査を行った。その結果、培養法では730検体中147検体(20.1%)、LAMP法では362検体(49.6%)が陽性であった。培養法陽性でLAMP法陽性の検体は4検体(1.1%)あり、菌数はいずれも40CFU/100ml未満であった。従って、LAMP法による検査は、実用上浴槽水のレジオネラ属菌汚染の評価に適用可能と判断する。

フローサイトメトリーに基づく新規評価基準による温浴施設水の衛生管理方法の有用性

目的
近年、厚生労働省の「公衆浴場における衛生管理要領」等に基づき、主に塩素系薬剤による浴用水の衛生管理が実施されているが、アンモニアの存在やpHの影響により充分な消毒効果が得られず規定の塩素濃度を保ちながらレジオネラ属菌が検出されることの問題点が指摘されている。今回、塩素管理を実施の循環式温泉の通年調査で、リアルタイムレジオネラリスク判定法を基に定めた新たな評価基準による衛生管理方法の有用性について検討した。

方法
平成18年8月〜翌年7月に温泉施設の各種浴用水(貯湯タンク水、配管水、浴槽水)を48回に分けて採水の170検体を上水試験法に準じてpH、有効塩素濃度、従属栄養細菌数の測定を行った。レジオネラ属菌の検出は新版レジオネラ症防止指針に従い、それと共にフローサイトメトリーにより粒子サイズ・核酸量を指標に細菌と推定される粒子を計測、更にCT値が10mg・min/Lとなるよう塩素剤で感作させた細菌を同機器で計測して得た特定エリアを二次元散布図内に定め、計測した推定細菌粒子群が当該エリアに局在する場合殺菌効果ありとする評価基準にて、前述の培養検査結果と比較した。

結果
評価基準を満たした55検体の内、3検体から従属栄養細菌が検出されたが何れもレジオネラ属菌は検出されなかった。一方、基準を満たさなかった115検体中105検体からは従属栄養細菌を検出、内69検体からはレジオネラ属菌が検出された。従って、フローサイトメトリーに基づいて設定した新規評価基準は施設従事者が簡便かつ迅速に温浴施設水のレジオネラリスクを探知することが出来、衛星管理上極めて有用である。

循環水からのL.pneumophila 検出法の比較

目的
院内の環境水調査方法を決定するため、「新版レジオネラ症防止指針」に示される冷却遠心濃縮法(以下遠心法)、ろ過濃縮法(以下ろ過法)、フィルター貼り付け法(以下貼り付け法)を用いて1)1検体当りの操作法(操作時間) 2)回収率について比較した。

方法
L.pneumophila SGIの標準株・臨床分離株で作成したA:100 CFU/100ml B:50CFU/100ml C:10 CFU/100mlの菌液を検体とし、①遠心法では200mlの菌液を遠心分離し、沈渣に水2mlを加え濃縮菌液とした②ろ過法ではマグネチックフィルターファンネル(日本ポール)を使用し、500mlの菌液を孔径0.45μlの滅菌メンブランフィルターでろ過後、フィルター上の菌を滅菌水5mlで洗い流し濃縮菌液にした。①②で得た菌液を100μlづつB-CYE培地に塗布した。
③取り付け法はマイクロファンネルプラス(日本ポール)を使用し、100mlの菌液を孔径45μmの滅菌メンブランフィルター(黒)でろ過し、フィルターを直接B-CYE培地に貼り付けた。
①〜③をそれぞれ35℃で乾燥を防ぎ10日間培養、計測した。

結果
1)操作法(時間)
①遠心法200mlの菌液を一度に遠心出来ず2回に分けて遠心、約140分を要した。
②ろ過法要した時間は30分だったが前日からの器具の滅菌作業などが必要であった。
③取り付け法30分を要した。2)回収率A〜Cの3濃度とも貼り付け法が最も優れていた。以上の結果から取り付け法が最も容易に短時間で検査が出来、安定した回収率を得られた。しかし、環境中の水の検査では酸処理、熱処理では処理出来ない雑菌も遠心法、ろ過法に比べ拾いやすくなるため、それに対する対策が必要と思われる。