液体培養(Liquid Culture) EMA-qPCR法を用いたレジオネラ生菌迅速検査法の評価

目的
EMA-qPCR法は操作の煩雑さや塩素消毒による膜損傷の程度でEMA感受性が異なる等の課題がある。我々は濃縮検体に液体培地を加えて培養後のrRNA増加量を評価することで生菌の有無、生菌数を測定するLiquid Culture(LC) RT-qPCRを開発した。しかし大量のレジオネラ死菌が存在する検体では数個の生菌による増加を検出できない欠点があった。今回、液体培養とEMA-qPCRを組み合せることで、EMA感受性や判定保留等の課題を解決した生菌検出キットを開発、これを用いて実試料で測定、評価したので報告する。

方法
LC EMA-qPCRキット(タカラバイオ試作品)に改良を加えて用いた。浴槽水の1000倍濃縮液100μlを液体培養し、EMA処理を行いDNAを抽出し、qPCR法にて測定した。入浴施設から採取した試料113件を用いて平板培養法とLC EMA-qPCR法でレジオネラ属菌数を算出した。

結果
レジオネラ標準菌(L.pneumophila)を用いてLC EMA-qPCRを行った場合、1CFU当りの16S rRNA遺伝子コピー数は液体培養前12コピー、18時間培養後270コピー、18時間培養EMA処理後100コピーと見積もられ、これを換算係数とした。113件のLC EMA-qPCR法の評価結果は、カットオフ値を5CFU/100ml相当に設定した場合の感度は95.5%、特異度は75.4%で、得られる定量値はEMA処理による死菌増幅抑制効果により平板培養法と良好な相関を示した。

考察
本法は平板培養法の結果を迅速に予測可能であり、浴槽水等におけるレジオネラ生菌遺伝子検査法としての活用が期待される。


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